CORSO INTEGRATO DI Biochimica I

ARGOMENTI E FINALITA

BIOELEMENTI

- Ruolo degli elementi plastici e oligodinamici.

OMEOSTASI BIOLOGICHE

- Regolazione dell’equilibrio idrosalino;

- Regolazione dell’equilibrio acido-base.

PROTEINE

- Struttura e funzioni.

MEMBRANE BIOLOGICHE

- Funzioni: Trasporto passivo, attivo e mediato di ioni e metaboliti..

ENZIMI

- Ruolo della catalisi biologica: cinetica enzimatica.

BIOENERGETICA

- Meccanismi di produzione dell’ATP: termodinamica delle reazioni cellulari.

PROTEINE PLASMATICHE

- Struttura, funzioni e correlazioni patologiche.

EMOGLOBINA

- Struttura, funzioni, metabolismo e correlazioni patologiche.

BIOCHIMICA DEGLI ACIDI NUCLEICI

- Struttura, sintesi e meccanismi di regolazione dell’espressione genica; controllo delle attività cellulari.

METODOLOGIE SEPARATIVE

- Centrifugazione e cromatografia: separazione di popolazioni cellulari, organuli subcellulari, macromolecole, biomolecole a basso peso molecolare.

MlETODOLOGIE QUALI/QUANTlTATIVE

- Spettroscopia UV/Vis-fluorescenza; valutazione qualitativa e quantitativa di intermedi metabolici.

IMMUNOMETRIA (RIA, ELISA, FIA)

- Determinazione quantitativa di composti di interesse biologico (ormoni, recettori, mediatori ormonali ed altri).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DEI CONTENUTI DELLA MATERIA DA UTILIZZARE COME TRACCIA PER LO STUDIO E PER GLI ESAMI

I BIOELEMENTI

- Elementi plastici: azoto, zolfo, calcio, fosforo, magnesio, sodio, potassio, cloro.

- Generalità sugli elementi oligodinamici: ferro, rame, zinco, manganese, cobalto, iodio, etc...

OMEOSTASI BIOLOGICHE

- REGOLAZIONE DELL’EQUILIBRIO IDRO-SALINO. Gamblegramma. Metabolismo del sodio e del potassio. Pompa sodio-potassio. Mineralcorticoidi; aldosterone: struttura, funzione e correlazioni fisiologiche. Spironolattone e idroclorotiazide. Ruolo del rene nell’omeostasi. Ultrafiltrazione glomerulare, riassorbimento attivo, secrezione tubulare. Meccanismo di secrezione competitivo tra H+ e K+ . Meccanismo di formazione dell’urina. Riassorbimento obbligatorio e facoltativo dell’acqua. ADH: (cenni sul diabete insipido). Meccanismo di moltiplicazione in controcorrente.

- REGOLAZIONE DELL’EQUILIBRIO ACIDO-BASE. Equazione di Henderson e Hasselbach, sistemi tampone plasmatici (proteina/proteinato, acido carbonico/bicarbonato, tampone dei fosfati).

- Tamponi emoglobinici, effetto hamburger (scambio dei cloroioni).

- Regolazione equilibrio acido-base renale; alterazioni dell’equilibrio acido-base (acidosi e/o alcalosi metabolica e/o respiratoria).

PROTEINE

- Legame peptidico. Struttura primaria. Metodi per la determinazione della sequenza degli aminoacidi. Struttura secondaria: a-elica; foglietto pieghettato o struttura b. I legami che stabilizzano la struttura terziaria delle proteine. Struttura quaternaria. Proteine fibrose: cheratine, collagene e collagenopatie, elastina. Proteine globulari. Denaturazione delle proteine. Metodiche elettroforetiche per la separazione delle proteine. Punto isoelettrico.

- Determinazione del peso molecolare mediante: ultracentrifugazione, cromatografia ad esclusione molecolare, elettroforesi su gel di poliacrilamide.

MEMBRANE BIOLOGICHE

1) trasporto di materia:

- Diffusione semplice

- Trasporto mediato da proteine specifiche (trasportatori o carrier): uniporto, c-trasporto (simporto, antiporto); trasporto passivo (diffusione facilitata), trasporto attivo (accoppiamento energetico primario o secondario). Esempi di trasporto attivo primario: Sodio-potassio ATPasi e potenziali di membrana; calcio-ATPasi. Esempi di trasporto attivo secondario: assorbimento del glucosio a livello intestinale.

- Trasporto di ioni e metaboliti attraverso la membrana mitocondriale intema (vedi bioenergetica mitocondriale).

- Canali ionici: voltaggio dipendenti e controllati da recettori (vedi anche elementi di neurochimica).

- Endocitosi mediata da recettori (vedi transferrina ed LDL).

2) Bioenergetica (vedi teoria chemioosmotica nella bioenergetica mitocondriale).

3) trasporto di informazione: (vedi meccanismo d’azione degli ormoni e cenni sulla neurotrasmissione).

ELEMENTI DI ENZIMOLOGIA

- Catalisi enzimatica:

Definizione di catalizzatore; meccanismo generale della catalisi ed energia di attivazione; apoenzimi, coenzimi, cofattori e gruppi prostetici; sito di legame per il substrato e sito catalitico; modelli di interazione enzima-substrato (modello della "chiave-serratura", modello dell’adattamento indotto); specificità di substrato.

- Cinetica enzimatica:

Richiami di cinetica chimica, (equazione e costante di velocità); Influenza della concentrazione del substrato sulla velocità di una reazione enzimatica (cinetica delle reazioni enzimatiche allo stato stazionario; complesso enzima-substrato; equazione dl Michaelis e Menten e sua rappresentazione grafica; significato della Km; (diagramma dei doppi reciproci). Inibizione enzimatica: inibizione competitiva, non competitiva ed incompetitiva. Inattivazione. Influenza del pII e della temperatura sulla attività enzimatica. Determinazione dell’attività enzimatica ed unità di attività enzimatica

- Allosterismo:

Sito allosterico e sito catalitico; modulatori o effettori allosterici (positivi o negativi) enzimi oligomerici; cooperatività; interazioni omotropiche ed eterotropiche; cinetica delle reazioni catalizzate da enzimi allosterici (curva sigmoide); subunità regolatrici catalitiche.

- Regolazione dell’attività enzimatica:

I) compartimentazione, Il) regolazione dell’espressione genica e concentrazione intracellulare della proteina enzimatica; III) modulazione dell’attività enzimatica: a) regolazione allosterica e controllo di una via metabolica: b) regolazione covalente (modificazioni post-traduzionali).

- lnduzione e repressione enzimatica

- Nomenclatura e classificazione degli enzimi:

Numero EC; classi enzimatiche (ossidoreduttasi, transferasi, idrolasi, liasi, isomerasi, ligasi).

- Isoenzimi.

- Nozioni elementari di enzimologia clinica:

Determinazione delle attività enzimatiche nel siero; CPK, LDII, transaminasi; enzimologia clinica nell’infarto del miocardio e nelle epatiti.

ELEMENTI DI BlOENERGETICA MITOCONDRlALE e CATENE RESPIRATORIE

- Richiami di termodinamica chimica; variazione di energia libera standard; chimica dell’ATP e composti ad alta energia; Ruolo dell’ATP nella bioenergetica.

- Richiami di elettrochimica: reazioni di ossido-riduzione; coppia redox; potenziale standard di ossidoriduzione. Relazione tra variazione di energia libera standard e differenza di potenziale standard di ossidoriduzione.

- Enzimi Ossidoriduttivi

- Coenzimi piridin-nucleotidici: NAD e NADP: struttura e funzione come trasportatori di idrogeno; coenzimi mobili; principi di spettrofotometria e legge di Lambert-Beer; spettro di assorbimento nell’ultravioletto delle forme ossidate e ridotte dei coenzimi piridinici; acido nicotinico e nicotinamide (vitamina PP); pellagra; biosintesi endogena dell’acido nicotinico.

- Catena mitocondriale di trasporto degli elettroni: membrana mitocondriale interna ed esterna; potenziali standard di ossidoriduzione dei componenti della catena di trasporto degli elettroni. Organizzazione della catena di trasporto degli elettroni in complessi lipoproteici della membrana interna (complesso I - II - III - IV) e componenti mobili (ubichinone e citocromo C). Coenzimi flavinici (struttura e funzione come trasportatori di idrogeno; FMN e FAD, riboflavina o vitamina B2). Ferrosolfoproteine; Struttura e funzione dei citocromi; Sruttura e funzioni del: Complesso I (NADII- ubichinone ossido reduttasi), Complesso II ( succinato-ubichinone ossido reduttasi), Complesso III (ubichinolo-citocromo C ossido reduttasi); Complesso IV (citocromo ossidasi). Inibitori del trasporto degli elettroni.

- Fosforilazione ossidativa: ATP sintasi mitocondriale (complesso V): struttura e funzione dei fattori F1 e Fo; rapporto P/O; ipotesi dell’accoppiamento chemiosmotico; gradiente elettrochimico di H+; controllo respiratorio; disaccoppianti inibitori della ATP sintasi

- Trasporto di ioni e metaboliti nei mitocondri: translocasi degli adenin nucleotidi; sistema di trasporto del calcio, del fosfato, del piruvato, degli acidi bicarbossilici e degli acidi tricarbossilici; sistema di trasporto aspartico-glutammico; sistema di trasporto a chetoglutarico-malico. Sistemi navetta per l’ingresso di equivalenti riducenti nel mitocondrio: sistema del glicerolo fosfato, sistema malato-aspartato

- il genoma mitocondriale.

- Catena microsomiale di trasporto degli elettroni.

RADICALI LIBERI

Definizione; effetti dei radicali liberi nei sistemi biologici; perossidazione dei lipidi insaturi ed alterazioni delle membrane biologiche; prodotti di riduzione parziale dell’ossigeno (anione superossido, acqua ossigenata e radicale idrossile). Reazione di dismutazione dell’anione superossido; reazione di Haber-Weiss. Difese biologiche nei confronti dei radicali liberi; superossido dismutasi; glutatione perossidasi, glutatione reduttasi, catalisi, vitamine E. Autoossidazione dell’emoglobina, metaemoglobina, metaemoglobina reduttasi. Cenni sulla patogenesi biochimica delle sindromi emolitiche da deficienza di glucosio-6-fosfato deidrogenasi. Granulociti neutrofili, macrofagi e NADPH ossidasi.

PROTEINE PLASMATICHE

- Plasma, siero, ematocrito.

- Elettroforesi: principi generali, separazione elettroforetica delle proteine del plasma.

- Albumina: struttura e funzioni (pressione oncotica, ipotesi di Starling e scambi a livello capillare, edema, funzioni di trasporto). Ceruloplasmina, aptoglobina, emopessina, transferrina (trasporto plasmatico del ferro, sideremia; capacità totale di legare il ferro; quoziente di saturazione della transferrina; endocitosi mediata da recettori per la transferrina; ferritina; nozioni elementari sulle conseguenze di una carenza di ferro: anemie sideropeniche).

- Immunoglobuline. Anticorpi, antigeni, e determinanti antigenici; struttura delle immunoglobuline (catene leggere e pesanti, regioni variabili e costanti, sito di legame per l’antigene, dominii, frammenti Fab e Fc; natura bifunzionale della molecola dell’anticorpo).

- Nozioni elementari sulle principali classi di immunoglobuline umane e loro funzioni; teoria della selezione clonale. Genetica delle immunoglobuline ed origine della diversità degli anticorpi

- Aspetti molecolari della differenziazione antigene-indipendente ed antigene-dipendente del linfocita B.

- (Ricombinazione V/D/J per le catene pesanti; ricombinazione V/J per le catene leggere; linfocita B e recettori per l’antigene; IgM di membrana e secrete; plasmacellule; commutazione di classe per la catena pesante).

- Nozioni elementari sulla produzione di anticorpi monoclonali.

- Metodi immunochimici: precipitazione dei complessi antigene-anticorpo; immunodiffusione radiale; metodi radioimmunologici; immunocitochimica.

- Cenni sul sistema del complemento.

- Aspetti biochimici della coagulazione del sangue: adesione ed aggregazione piastrinica; struttura del fibrinogeno; monomeri di fibrina e fibrinopeptidi; fattore stabilizzante la fibrina; protrombina e trombina; via intrinseca ed estrinseca; nozioni elementari su fattore VIII ed emofilia; sistema fibrinolitico; eparina ed antitrombina; vitamina K.

STRUTTURA, FUNZIONI E METABOLISMO DELL’EMOGLOBlNA

- Struttura e funzioni. Curva di dissociazione dell’emoglobina-effetto Bohr - 2,3 DPG Emoglobinopatie. (Anemia falciforme, b-talassemia, emoglobine umane mutate)

- Metabolismo del ferro: distribuzione del ferro nell’organismo umano, assorbimento intestinale, trasporto nel sangue (transferrina e meccanismo di endocitosi mediata da recettori, sideremia, (vedi anche proteine plasmatiche), deposito (ferritina, emosiderina) Cenni sulle anemie sideropeniche.

- Biosintesi dell’eme: acido d -amino levulinico, porfobilinogeno, uroporfirinogeno III coproporfinogeno 111, protoporfirina IX, eme,. Regolazione del’enzima ALA sintetasi; Cenni sulle porfirie e sul saturnismo.

- Catabolismo dell’emoglobina e formazione dei pigmenti biliari: eme ossigenasi; biliverdina, bilirubina; bilirubina diglucuronide; reazione di Van der Bergh (bilirubina diretta, indiretta), urobilinogeno e urobilina; stercobilinogeno e stercobilina; circolo enteroepatico dei bilinogeni. Cenni sulla classificazione degli itteri (ittero emolitico, epato-cellulare, da colestasi).

BIOCHIMICA DEGLI ACIDI NUCLEICI

- METABOLISMO DEI NUCLEOTIDI

Biosintesi "de novo" dei nucleotidi pirimidinici e sua regolazione. Biosintesi de novo dei nucleotidi purinici e interconversione. Trasformazione dei ribonucleotidi in deossiribonucleotidi; Via di recupero delle basi. Catabolismo dei nucleotidi purinici ed acido urico; le iperuricemie (gotta primaria, secondaria).

- IL MATERIALE GENETICO É DNA:

Trasformazione degli pneumococchi: esperimenti di Griffith (1928); il DNA è il fattore trasformante: esperimenti di Avery (1944); il DNA del batteriofago T2: esperimenti di Hershey e Chase (1952); transfezioni (1980).

- STRUTTURA DEL DNA:

Desossiribosio, ponti fosfodiesterici, basi azotate; la sequenza delle basi si scrive in senso 5g3; doppia elica (Watson e Crick 1953); accoppiamento di basi complementari mediante legami ad idrogeno; catene antiparallele; struttura a doppia elica alternative (DNA A, B, Z) Denaturazione del DNA; effetto ipocromico; temperatura di fusione (Tm); rinaturazione

- TOPOLOGIA DEL DNA:

Numero di legame; Writhe: superelica o superavvolgimento (positivo o negativo); twist: avvolgimento; Isomeri topologici; DNA topoisomerasi di tipo I e di tipo II.

- REPLICAZIONE DEL DNA.

La replicazione del DNA è semiconservativa (esperimento di Meselson e Stahl, 1958); Le DNA polimerasi di E. Coli: DNA polimerasi I, II, III. DNA polimerasi I: desossiribonucleosidi 5-trifosfati; Mg ++, catena d’inizio, catena stampo. Le DNA polimerasi catalizzano l’allungamento delle catene di DNA nella direzione 5 g3 Le attività esonucleasiche. 3’g5' e 5'g3 della DNA polimerasi I. DNA polimerasi di mammifero (a, b, y).

- La replicazione del DNA in E. Coli: Origine della replicazione. Il DNA circolare viene replicato bidirezionalmente. Replicazione semidiscontinua: Catena veloce, catena ritardata, frammenti di Okazaki; primasi elicasi, proteina SS legante, DNA girasi, oloenzima della DNA polimerasi III, DNA polimerasi i, DNA ligasi. La replicazione del DNA circolare: replicazione teta; replicazione sigma o a cerchio rotante; l’ansa D del DNA mitocondriale. Forme replicative dei batteriofagi con DNA a singola elica.

MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA: (in E. Coli:)

- Danno da UV e dimeri di timidina:

1) riparazione per fotoriattivazione

2) riparazione per excisione: endonucleasi specifica per gli UV.

3) riparazione ricombinativa o postreplicativa.

- Desaminazione della citosina ad uracile e riparazione per excisione: uracil-DNA glicosidasi, endonucleasi AP.

- I sistemi di riparazione del DNA nell’uomo e lo xeroderma pigmentoso;

LA RICOMBINAZIONE E LA MOBILITA GENICA.

- Ricombinazione generale, sito-specifica, trasposizione.

- La trasposizione avviene mediante ricombinazione replicativa: duplicazione del trasposone, specificità della sequenza bersaglio, la duplicazione della sequenza bersaglio e le sequenze ripetute dirette.

Il ciclo replicativo dei retrovirus comporta eventi simili alla trasposizione.

Transfezione; animali transgenici.

- La generazione della diversità degli anticorpi e la combinazione somatica V-J o V-D-J (vedi anche immunoglobuline, proteine, plasmatiche).

STRUTTURA, SINTESI E MATURAZIONE DELL’RNA

E DELLE RIBONUCLEOPROTEINE. LA TRASCRIZIONE

Il promotore ed il sito di inizio delle trascrizione.

- RNA polimerasi di E.Coli: oloenzima, core (a2 bb1), fattore sigma. Il ciclo del fattore sigma. Le catene di RNA vengono sintetizzate in direzione 5'g3'

La rifampicina inibisce selettivamente l’inizio della sintesi dell’RNA.

- RNA polimerasi eucariotiche: RNA polimerasi I, II, III; a basse concentrazioni l’amanitina è un inibitore della RNA polimerasi II.

- I promotori batterici:

Definizione di sequenza consenso. Pribnow box o sequenza-10 (TATAAT); TTGACA sequenza -35.

- Promotori eucariotici: TATA box o Hogness box (-25); CAAT box (-75); (vedi anche controllo dell’espressione genica). Promotori interni per l’RNA polimerasi III.

- Terminazione (in E. Coli). Palindromi sono presenti in ogni terminatore procariotico; terminazione rho-indipendente e rho-dipendente; l’antiterminazione nel fago lambda.

RNA RIBOSOMIALI E RIBOSOMI:

I ribosomi sono particelle ribonucleoproteiche. I ribosomi batterici: ribosoma 70S; subunità 30S e 50S; RNA ribosomiale 16S, 23S, 5S. I ribosomi dei mammiferi: ribosomi 80S; subunità 40S e 60S; RNA ribosomiale 18S, 28S, 5,8 S e 5S. Ruolo nella sintesi proteica, sito P e sito A (vedi sintesi proteica). L’RNA ribosomiale è metilato (2'-0-metilriboso). La struttura secondaria dell’rRNA ha molte brevi regioni a doppio filamento.

Nei batteri gli rRNA 16S, 23S, 5S sono sintetizzati come parte di un trascritto primario comune 30S. Il precursore 30S è tagliato dall’RNAsi III. Nei mammiferi il trascritto primario è un rRNA di 45S che contiene le sequenze 18S; 5,8 S; 28S. RNA polimerasi I. Nei mammiferi i geni dell’rRNA sono presenti come copie multiple adiacenti (gruppi di geni in tandem). Il nucleolo. I geni dell’ rRNA 5S nei mammiferi sono trascritti dall’RNA polimerasi III;

RNA TRANSFER (75-95 BASI)

tRNA isoaccettori; struttura secondaria a trifoglio: braccio accettore, braccio TYC, braccio dell’anticodon, braccio D, braccio extra. Basi modificate: struttura terziaria a forma di L

Aminoacil-tRNA sintetasi: meccanismo della reazione (aminoaciladenilato come intermedio).

- Sintesi e maturazione degli RNA transfer. Riconoscimento codon-anticodon: un tRNA può riconoscere più di un codon; ipotesi dell’oscillazione (wobble) nell’accoppiamento della terza base del codon.

RNA MESSAGGERO

Nei batteri: breve emivita; la trascrizione, la traduzione e la degradazione dell’mRNA procedono simultaneamente nei batteri; mRNA mono e policistronici; regioni codificanti, leaders, trailers, regioni intercistroniche; la sequenza di Shine e Dalgarno degli mRNA batterici e la sequenza dell’estremità 3' dell’rRNA 16 S.

Negli eucarioti:RNA polimerasi II. Il cap dell’estremità 5': guanosina legata con legame 5-5 trifosfato. L’azoto N-7 della guanina terminale è metilato (cap. O). Metilazione dei ribosi e cap. 1 e 2.

- Gli mRNA degli eucarioti contengono una coda di poli(A) all’estremità 3'; la coda di poli(A) (250 basi) è aggiunta nel nucleo dopo la trascrizione; segnale di taglio e poliadenilazione di un trascritto primario (AAUAAA); poli A polimerasi; mRNA degli istoni è poli(A). Purificazione del RNA poli(A)+ mediante oligo (dt) cellulosa

- Esoni, introni e lo splicing dei precursori degli mRNA. Un introne inizia con GU e termina con AG. Sito di ramificazione ed intermedi a cappio dello splicing. Spliceosoma. Le piccole particelle ribonucleoproteiche nucleari (Snurps).

SINTESI PROTEICA:

Il Codice genetico.

L’INIZIO DELLA SINTESI:

- nei procarioti: tripletta AUG (o GUG) N-formil-metionil-tRNA iniziatore; fattori di inizio: formazione del complesso 30 S-mRNA f Met-tRNA e ruolo di IF2.

- negli eucarioti: tripletta AUG, Met-tRNA di inizio, fattori di inizio eucarioti: eIF. complesso e IF2 met-tRNA -40 S-mRNA.

L’ALLUNGAMENTO:

- i siti del ribosoma: i siti P, sito A.

A) Ingresso dell’aminoacil-tRNA nel sito A; fattori di allungamento (EF) e GTP

B) Formazione del legame peptidico: peptidil-transferasi.

C) Translocazione.

LA TERMINAZIONE:

- Codoni di terminazione (UAG, UAA, UGA);fattori di rilascio(RF).

- Alcuni antibiotici inibiscono la sintesi proteica: meccanismo d’azione della streptomicina, cloramfenicolo, tetraciclina, eritromicina.

IL NUCLEOSOMA E LA STRUTTURA DELLA CROMATINA:

I componenti proteici della cromatina: istoni (Hl, H2A, H2B, H3, H4) e proteine non istoniche. Il nucleosoma; il DNA core e il DNA linker; il DNA è avvolto attorno all’ottamero istonico.

CONTROLLO DELL’ESPRESS1ONE GENICA:

Nei procarioti induzione e repressione enzimatica; operone: geni strutturali, geni regolatori, operatore, promotore, repressore, induttore. Il lac-operon. Ipotesi di Jacob e Monod. negli eucarioti: struttura del gene, introni ed esoni, splicing, promotore, enhancer, fattori trascrizionali.

LA MANIPOLAZIONE DEL DNA:

DNA ricombinante ed ingegneria genetica; enzimi di restrizione; trascrittasi inversa; cDNA; vettori di clonaggio: plasmidi e fagi. Genoteche (genomiche o di cDNA). Southern e Northem blotting; metodiche di ibridazione degli acidi nucleici (cenni).